抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測(cè)試劑盒(PNP 微板法)的產(chǎn)品介紹

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布極廣泛，遍布各種組織，主要存在于細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，所以常作為溶酶體標(biāo)志酶。溶酶體外的酸性磷酸酶存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞質(zhì)內(nèi)，各種動(dòng)物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的適宜 pH 值為 4.5～5.5；存在于正常人肺泡巨噬細(xì)胞和白血病人脾臟的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)

均在細(xì)胞濾泡中，并不是釋放入血液，血液中的 TRAP 絕大多數(shù)來(lái)源于破骨細(xì)胞，因此可以通過(guò)測(cè)量血液中的 TRAP 了解破骨細(xì)胞的功能狀態(tài)，幾乎被認(rèn)為是是機(jī)體破骨活性的唯一血液指標(biāo)，TRAP 是一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細(xì)胞(osteoclast)和破軟骨細(xì)胞

(chondroclast)中高表達(dá)，在活化的巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元中也有表達(dá)。

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測(cè)試劑盒(PNP 微板法)(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)檢測(cè)原理是利用 p-nitrophenyl phosphate (pNPP) 為一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性 條件下可在 ACP 的作用下生成 p-nitrophenol (p-NP)；在堿性條件下 p-NP 呈黃色，黃色越深說(shuō)明 ACP 活性越高，反之則酶活性越低，在 400～415nm 處有最大吸收；在適量的酒石酸存在的情況下進(jìn)行 ACP活性檢測(cè)，得到的 ACP 活性就是 TRAP 的活性，根據(jù) p-NP 的生成量即可計(jì)算出 TRAP 的活性水平，可用于檢測(cè)細(xì)胞或組織的裂解液或勻漿液、血漿、血清、尿液等樣品中內(nèi)源性的TRAP 活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品：

①血漿、血清和尿液樣品：血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測(cè)定，尿液通常也可以直接用于測(cè)定，-20℃凍存，用于 TRAP 的檢測(cè)。

②細(xì)胞或組織樣品：取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)勻漿，一般細(xì)胞數(shù)量在 106 以上，組織應(yīng)在 100mg 以上，3000~4000g 離心取上清， -20℃凍存，用于 TRAP 的檢測(cè)。

③植物樣品： 取適量的植物組織加入少量 PBS 或生理鹽水， 充分搗碎或研磨，靜置 30min，用紗布或?yàn)V紙過(guò)濾，4000g 離心 20min，留取上清液并測(cè)量體積，-20℃凍存，

用于 TRAP 的檢測(cè)。

④高活性樣品：如果樣品中含有較高活性的 TRAP，可以使用 ACP Assay Buffer、PBS

或生理鹽水稀釋后再行檢測(cè)。

2、配制顯色工作液： 取出 1 支 pNPP，恢復(fù)至室溫后溶解于 2.5ml ACP Assay Buffer，

混勻，冰上預(yù)冷備用，新配制的顯色工作液應(yīng)在 6h 內(nèi)用完。

3、配制系列標(biāo)準(zhǔn)品：取出 p-nitrophenol(10mM)恢復(fù)至室溫，離心機(jī) 10000rpm 離心 5min，按p-nitrophenol(10mM)：ACP Assay Buffer=1：19的比例混合，使?jié)舛冗_(dá)到0.5mM，-20℃凍存?zhèn)溆茫话聪卤砝^續(xù)稀釋：

5、TRAP 測(cè)定：輕輕混勻，37℃孵育 25～30min，每孔加入 160μl Stopping Solution

終止反應(yīng)；以空白調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定 405nm 處標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管的吸光度。

計(jì)算：

系列標(biāo)準(zhǔn)品(1~6 號(hào))濃度(即 p-NP 含量)0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02

μM 為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定孔的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測(cè)樣品 p-NP 的生成量。酸性磷酸酶活性單位的定義：在 pH 值 4.8 37℃條件下，每分鐘水解 pNPP 顯色底物產(chǎn)生 1 μM p-NP 所需的酸性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位，根據(jù)酶活性定義，計(jì)算出樣品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。TRAP 酶活性(μM/min)=待測(cè)樣品 p-NP 生成量/孵育時(shí)間

注意事項(xiàng)：

1、待測(cè)樣品中不能含有磷酸酶抑制劑，同時(shí)需避免反復(fù)凍融。

2、如果待測(cè)樣品體積較少，可減少樣品加樣量，以 ACP Assay Buffer 補(bǔ)至 30μl。

3、如果無(wú)法檢測(cè) 405nm，亦可檢測(cè) 400～415nm 范圍內(nèi)吸光度。

4、建議每次測(cè)定時(shí)都最好作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以使標(biāo)準(zhǔn)更準(zhǔn)確，另外標(biāo)準(zhǔn)品避免反復(fù)凍融。

5、如果沒(méi)有酶標(biāo)儀，也可以使用普通的分光光度計(jì)測(cè)定，但應(yīng)考慮根據(jù)比色杯的最小檢測(cè)

體積，盡量采用小體積的比色杯。

6、所測(cè)樣品的含量高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，應(yīng)用 ACP Assay Buffer 稀釋樣品后重新測(cè)定。

7、配制 1 支顯色工作液后應(yīng)當(dāng)日用完，因此請(qǐng)注意適當(dāng)多準(zhǔn)備一些樣品一起檢測(cè)。

8、p-nitrophenol 溶液對(duì)人體有害，反應(yīng)終止液有腐蝕性，請(qǐng)小心操作。

9、如果希望進(jìn)行酶活性的絕對(duì)定量，進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)應(yīng)精確計(jì)時(shí)，此時(shí)推薦采用孵育 30min或更長(zhǎng)時(shí)間，以減小操作過(guò)程中的時(shí)間誤差。

10、待測(cè)樣品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至 30min。

有效期：12 個(gè)月有效；4℃運(yùn)輸，-20℃保存。

 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)檢測(cè)試劑盒(PNP 微板法)的產(chǎn)品介紹