脫氫抗壞血酸(DHA)檢測試劑盒(菲咯啉微板法)的操作步驟

產品簡介：

維生素 C(Vitamin C)又稱 L-抗壞血酸(AsA)，是高等靈長類動物與其他少數(shù)生物的必需營養(yǎng)素，在生物體內維生素 C 是一種抗氧化劑，為酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸內酯，保護身體免于自由基的威脅，同時也是一種輔酶，其廣泛的食物來源為各類新鮮蔬果。Vc有 L-型和 D-型兩種異構體，只有 L-型的才具有生理功能，還原型和氧化型都有生理活性。

脫氫抗壞血酸(DHA)檢測試劑盒(菲咯啉微板法)檢測原理是利用還原劑將脫氫抗壞血酸還原成還原型抗壞血酸，在酸性條件下維生素 C(抗壞血酸)把三價鐵離子還原成亞鐵離子，后者與菲咯啉形成穩(wěn)定的紅色螯合物，以酶標儀 534nm 處檢測吸光度，在一定濃度范圍(樣品濃度控制在 10~250μg/ml)吸光度與抗壞血酸含量呈線性關系，獲得抗壞血酸含量。該試劑盒主要用于植物組織中的維生素 C(抗壞血酸)的檢測，計算出總抗壞血酸含量，從中減去樣品中原有的還原型抗壞血酸含量，即得脫氫抗壞血酸含量。優(yōu)點是：1、反應穩(wěn)定，不易褪色；2、操作簡便；3、還原糖及其他常見的還原物質對實驗沒有干擾，因此專一性好；4、靈敏度高。本試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。 

操作步驟(僅供參考)：

1、稀釋組織勻漿液：按組織勻漿液(5×)：蒸餾水=1：4 的比例稀釋，獲得 1×組織勻漿液，待用。

2、制備 AsA 提取液：取待測材料如青菜、水果、松針等，清洗擦干，準確稱量 2.5g，加入研磨器內，再加入少量 1×組織勻漿液，研磨碎，留取上清，再次用 1×組織勻漿液研磨，最后一并倒入 50ml 離心管，補充 1×組織勻漿液至 22.5ml，充分混勻，4000g 離心 5min，留取上清液即為 AsA 提取液。

3、制備 DHA 待測液：取 4ml AsA 提取液，加入 2ml DHA 還原液，用 NaOH 溶液調節(jié)pH 至 7~8，室溫下靜置 10min，使脫氫抗壞血酸還原成抗壞血酸，再加入 1.6ml 組織勻漿液(5×)和 0.4ml 蒸餾水即為 DHA 待測液。

4、配制系列抗壞血酸標準：取干凈的 96 孔板，按下表進行操作，依次稀釋。

5、DHA 加樣：按照下表設置空白孔、標準孔、AsA 測定孔、DHA 測定孔，溶液應按照順序依次加入，并注意避免產生氣泡。如果樣品中的抗壞血酸含量過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測最好能設置 2 平行孔，求平均值。

6、DHA 測定：立即混勻，以空白調零，酶標儀測定 534nm 處系列標準孔、AsA 測定孔、DHA 測定孔的吸光度。

計算：以系列標準抗壞血酸(5、10、20、30、40、50μg)為橫坐標，以對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程。以 AsA 測定孔吸光度代入回歸方程求得 AsA 提取液中 AsA 含量；以 DHA 測定孔吸光度代入回歸方程求得 DHA 待測液中總 AsA 含量；總 AsA 含量與 AsA 提取液中 AsA 含量的差值即為脫氫抗壞血酸(DHA)含量。

DHA 含量(mg/100g)=(m0×VT×100)/(m1×VS×1000)

式中：m0=總 AsA 含量與 AsA 提取液中 AsA 含量的差值(μg)

VT=待測液的總體積(ml)

m1=樣品質量(g)

VS=測定時取樣體積(ml)

100=100g 

注意事項：

1、 上述低溫試劑避免反復凍融，以免失效或效率下降。

2、 組織勻漿液(5×)久置或低溫保存，容易產生乳白色渾濁；如果白色渾濁不明顯，可以直

接使用，不影響效果；如果白色渾濁較多，應棄用。

3、 待測樣品如不能及時測定，應置于 2~8℃保存，3 天內穩(wěn)定。

4、 如果樣品濃度過高，應用蒸餾水稀釋后重測，結果乘以稀釋倍數(shù)。

有效期： 6 個月有效。4℃運輸，4℃保存。

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