瓊脂糖-重組耐堿蛋白A 親和填料的使用參考方法

產(chǎn)品介紹

rat-PANUPharoseFF是一款抗體親和填料，F(xiàn)F為Fast Flow的縮寫(xiě)，意味該填料可在高流速下工作。

重組耐堿蛋白A配基由大腸桿菌表達(dá)，不含動(dòng)物來(lái)源。rat-PANUPharoseFF的基球與配基通過(guò)單點(diǎn)偶聯(lián)而成，加之基因工程改造，其對(duì)人IgG 的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量穩(wěn)定在45mg/mL，可耐受0.1~0.5M濃度的NaOH溶液清洗和去除熱源，純化過(guò)程具備配基掉落少、宿主細(xì)胞蛋白含量低的特點(diǎn)。相較于ProA NUPharose FF，本產(chǎn)品保持了對(duì)人、小 鼠、大鼠、兔、牛等等來(lái)源的多種類(lèi)型和亞型的抗體有親和作用，可從腹水、血清、細(xì) 胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物不同亞型的抗體或包含抗體Fc片段的基因工程重組蛋白，可滿(mǎn)足不同規(guī)模的研究或生產(chǎn)嚴(yán)格的清潔要求。

色譜柱裝填

以下闡述與層析系統(tǒng)連接時(shí)，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計(jì)算：通過(guò)沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱(chēng)壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全讀取的穩(wěn)定體積。rat-PANUPharoseFF的壓縮比為1.15。為使達(dá)到裝柱比，可通過(guò)柱頭下壓的方法，也可以通過(guò)高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應(yīng)體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復(fù)3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準(zhǔn)備：將填料轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦�，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準(zhǔn)備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下端的空氣，在柱內(nèi)保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調(diào)整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內(nèi)（必要時(shí)使用裝柱器），為避免引入氣泡，應(yīng)使之沿層析柱內(nèi)壁自然流下。將所有填料加入后，用裝柱液將裝柱器加滿(mǎn)，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統(tǒng)連接。

（7）壓柱：使柱內(nèi)填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過(guò)高流速（推薦流速見(jiàn)下表，注意柱壓不超過(guò)0.3MPa），繼續(xù)壓柱至界面清晰穩(wěn)定，標(biāo)記界面穩(wěn)定時(shí)的柱高。停泵，打開(kāi)柱頭上的閥門(mén)/堵頭，關(guān)閉柱底的閥門(mén)/堵頭，下壓柱頭至標(biāo)記位置下方與壓縮比對(duì)應(yīng)的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內(nèi)的填料。

洗脫與再生（Elution & Regeneration）

最常用的洗脫方式為pH=2.5~4.0的甘氨酸、檸檬酸鹽或乙酸鹽，該條件可基本將抗 體完全洗脫。但該pH較低，可能會(huì)使一些抗體失活或聚集，在條件篩選階段可逐步降低pH，篩選出收率可接受、抗體不失活或不聚焦的最高pH。也可以將洗脫液收集在弱堿性的緩沖液中，中和至中性，以縮短低pH條件的接觸時(shí)間。洗脫之后，可用5~10個(gè)柱體積的洗脫液對(duì)色譜柱進(jìn)行再生。